摘要：中药的质量标准 研究 除少量采用形态法（包括显微）外，一般均用 现代 理化 分析 方法 。直到1995年版药典，中药质量标准尚未有分子生物学 理论 和方法的 应用 ，这与当今分子生物学的 发展 是极不相称的，也不利于中药自身发展及指导临床。应当以中药品种分子遗传特征进行中药质量标准研究的新思路。

　　主题词：中药质量标准 分子免疫学 研究

　　一、免疫学研究特点

　　大多数植物的初级或次级代谢产物，因其专属性强，又可与化学对照品比较测定，常作为中药质量标准或指标性成分。但是单一化学成分所携信息量有限，不同亲缘种，亚种间常含相同成分，例如黄柏与黄连均含小檗碱。同一品种在环境因素作用下也可能含不同质和量的化学成分。至于动物类中药，由于缺乏特异的次级代谢产物，更难以某种“化学成分”进行专属鉴别。分子生物学研究决定遗传特征的信息大分子，包括DNA、RNA及蛋白质，故可针对中药的物种进行鉴别和质量评价。以分子遗传标记进行中药鉴别，由于可以区别亲缘关系的种、亚种甚至居群，对环境因素有较大保守性，将会对中药的分类学、药剂学及质量标准研究产生极其深刻的 影响 。我们认为以中药物种遗传特征作质量标准或者作理化分析的补充，有利于保护地道药材，有利于临床根据中医理论用药，也有利于市场防伪。由于国外容易接受药材种属遗传特征的质量观念，反而不理解诸如小檗碱作为天然黄连质量标志的习惯，所以也还有利于出口准入。对于动物类中药，甚至可能成为解决专属鉴定的基本方法。

　　二、免疫学研究现状

　　1、传统蛋白质分析 早在20多年前即有人提出以种属蛋白特征进行中药鉴别思路，先后报道氨基酸含量、电泳、同工酶及免疫血清等，至今仍在继续。主要 问题 是不规范，难以重复。鉴于部分中药材及制剂中蛋白已有不同程度的水解，故近年发展的X衍射、核磁共振、质谱、HP以及毛细管电泳等测定蛋白质的新技术，均难以直接用于质量标准。一般免疫化学法采用全价抗原分析，却不能用于亲缘接近的品种鉴别。

　　2、DNA分子标记　DNA作为遗传信息的直接载体，不受环境因素、个体发育阶段及组织部位影响。而且DNA化学稳定性高，在一般贮存条件下不易降解，所以近年DNA分子标记鉴别发展很快。从1994年香港中文大学首次报告随机引物多聚酶反应（AP-PCR或RAPD）鉴别人参和西洋参以来，鉴别的中药已达30～40个品种，有的甚至申请了专利。但是 目前 DNA鉴别仍限于中药材的分析，对于多种中药组成的复方制剂，随机多态分析技术不适用于混合模板。建议加快建立重要中药材基因库，寻找出品种高度保守的特异DNA序列，合成专属的引物，才能真正应用于中药制剂的质量标准研究。

　　3、蛋白质分子免疫标记　从海王“金牡蛎胶囊生化免疫鉴别及含量测定研究”项目中，提出了一个不同于传统蛋白质分析的思路。其核心是确证55KD多肽是牡蛎种属特征蛋白（抗原），纯化并制定该蛋白质的质控条件，制成免疫学对照品。然后免疫动物制备抗体作为检测药盒。采用不同方法可在10-3g及10-9g范围与其他贝类鉴别。其线性、精密度、重现性和稳定性及回收试验等方法学考察，均接近理化分析要求。实际上已用于 企业 内部质量标准，其后证明用此方法可检出健民“龙牡壮骨冲剂”中极微量的牡蛎蛋白。

　　转贴于论文联盟 http://www.lwlm.com三、主要步骤及关键技术

　　1、免疫学对照品的设立和质控

　　1）中药材种属特征蛋白的确证：能否取得含量丰富、抗原性强，既是药典规定入药的各亚种间共同蛋白，又不与其他类似品种交叉的特征多肽（抗原），是整个质量 研究 成败的关键和难点。除经典的电泳 分析 （SDS-PAGE、Native-PAGE、IEF、2D电泳、糖蛋白电泳）外，推荐“免疫吸收印迹电泳”技术。即先将药材提取蛋白质，免疫动物制备全价抗血清，逐一加入待鉴别品种“吸收”血清中交叉的抗体，然后用吸收后血清作一抗进行免疫印迹（westernblot），未被吸收的组分极可能具特异性。再结合分子量，等电点及排除糖蛋白、脂蛋白后，可确定为该种属特征蛋白。

　　2）种属特征蛋白纯化及多克隆抗体制备：目的是对初步确证的蛋白质作进一步考察。如果仅作市场防伪或 企业 内部质控，提取的蛋白质只要分子量明确，SDS-PAGE基本上一条带，交叉免疫单一峰，再测定蛋白质含量，即可作为粗对照品。以此免疫家兔，测定抗体滴度大于1/64，制备IgG酶结合物，已可满足 应用 的要求。特征蛋白纯化可从SDS-PAGE直接制备，但多数情况下仍使用盐析（分子筛）或凝胶过滤（离子交换 方法 ）制备。

　　3）种属特征短肽序列分析：天然纯化的蛋白质分子量仍较大，性质不均一，其质量受提取方法 影响 很大，与化学对照品技术要求距离较大。我们认为，用于中药新药质量标准的免疫学对照品，应当具有氨基酸序列清楚、抗原性专一、稳定性强及便于制取供应等条件，只有简单线性多肽能符合这些条件。

　　4）种属特征短肽人工合成：由于抗原决定簇表达只须一级结构，可采用固相多肽合成法制备，简单过凝胶柱纯化及验证抗原性存在，即达到免疫学对照品要求。至于采用噬菌体肽库技术确定特征短肽，简并寡核苷酸合成小肽CDNA片段在噬菌体颗粒表面表达这一短肽，可能更快捷有效，但我们尚无这方面的经验。

　　2、检测试药——特异抗体制备

　　常规制备多肽抗体，可采用半抗原联接蛋白形成完全抗原，产生多克隆或单克隆抗体。近年来第三代抗体，即工程抗体技术已商品化。为提供标准化的抗体库，厂家备有多个系统试剂盒。只须从免疫小鼠脾淋巴细胞或杂交瘤细胞，提取mRNA与药盒的引物作PT-PCR克隆Vh和Vk基因，经DNA接头连接后与噬菌体PCANTAB5重组，转化大肠杆菌制备抗体进行“吸附—洗脱—扩增”的筛选富集，再经转染即可得到高亲和力的抗该种属特征短肽的单链抗体。随基因工程技术普及，估计工程抗体生产成本还会降低。

　　3、专属鉴别及含量测定方法

　　1）一般免疫化学法：采用免疫沉淀技术，适用于10-3g～10-5g范围特征多肽的鉴别。例如免疫双扩散用在专属鉴别及火箭电泳用来进行含量测定。该方法假阳性少，质控好。

　　2）酶标记免疫法：有的中药含特征多肽量极微，如珍珠、牡蛎等，须高达10-9g以上才能检出。通常采用酶标免疫，甚至放大技术。斑点酶联免疫分析（DIBA）可以鉴别，将1～2μl中药提取液点样在NC膜上，用直接或间接酶结合抗体检测，阳性斑点呈红褐色。我们在牡蛎制剂鉴别中可达1ng。含量测定则用酶联免疫吸收分析（ELISA），用双抗体夹心测定牡蛎特征蛋白，在0。05μg～0。90μg呈线性，RSD为6。6%，平均加样回收率110%，最低检测限5ng。近年来 发展 的增强化学发光及免疫PCR技术，使检测限提高到10-12g以上，将会使分子免疫学进行中药质量标准研究更灵敏。

　　有关人工合成对照品与天然蛋白质，工程抗体与天然抗体间反应有何差别，孰优孰劣？还有待实践后回答。分子生物学用于中药质量标准研究才刚起步，究竟哪些中药适于理化分析，哪些适于DNA分析或适于分子免疫分析，也要实践后 总结 。 目前 ，应当集中力量进行中药免疫学对照品研究，争取获得药检部门的认定和通过审批程序进入中药新药质量标准，并且最终收载入药典。

　　最近有学者强调草药质量标准可能形成两个分支：一支是接近化学药品质量标准的对某一化学成分的定性定量分析，另一支是“全成分”的色谱图象或指纹图谱分析。并且明确指出后者可提供对品种辩认的更多信息，更适应中医传统 理论 的需要。转贴于论文联盟 http://www.lwlm.com